РЕЗЮМЕ. Speciation-анализ (анализ химических форм элементов) – это важное направление в аналитической химии, которое позволяет определять не только общее содержание элемента, но и его конкретные химические формы (виды). Как правило, для speciation-анализа микроэлементов необходимы два взаимодополняющих метода – разделение и обнаружение. Первый обеспечивает эффективное и надежное разделение форм, а второй – адекватное обнаружение и количественную оценку. Это особенно важно для понимания биодоступности, токсичности и экологического воздействия элементов. Рассмотрены наиболее современные, применяемые и доступные методы детектирования форм некоторых химических элементов. Прогресс в аналитических инструментах и методологии позволяет идентифицировать и анализировать формы, представленные в конкретной индивидуальной системе.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: speciation анализ, масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой, атомная спектрометрия, селен, мышьяк, ртуть.
Для цитирования: Ляпуновский Д.М. Методы детектирования при проведении speciation-анализа в биомедицинских исследованиях. Микроэлементы в медицине. 2025;26(3):11−15. DOI: 10.19112/2413-6174-2025-26-3-11-15.
ВВЕДЕНИЕ
Для speciation-анализа обычно используется сочетание детектирующих методов с высокочувствительным и селективным детектором, таких как масс-спектрометрия (МС) или атомная спектрометрия, включая атомно-флуоресцентную спектрометрию (АФС), атомно-абсорбционную спектрометрию (ААС) и атомно-эмиссионную спектроскопию (АЭС) или оптико-эмиссионную спектрометрию (ОЭС). Химическая форма и количественная информация об элементе могут быть получены и с помощью базовых химических методов.
Следует отметить, что, хотя в анализе, основанном на хроматографическом разделении с использованием детекторов атомной спектрометрии или масс-спектрометрии, достигнут значительный прогресс, и эти методы могут предоставить наиболее полную информацию об относительном распределении и даже о структуре, он также имеют свои недостатки. Ограничением, связанным с переносом технологии в биомедицинские исследования, является малый объём пробы, вводимой в систему, что приводит к необходимости использования очень чувствительного детектора. Представляется, что нехроматографические методы являются более подходящими в том случае, когда объем пробы неограничен, и, таким образом, можно использовать менее чувствительные и менее дорогие детекторы благодаря возможности разделения и предварительного концентрирования желаемых веществ. Кроме того, инвестиционные и эксплуатационные расходы иногда также играют важную роль в ограничении распространения speciation-анализа в качестве рутинной задачи.
МЕТОДЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ
Процесс выбора подходящих методов детекции определяется несколькими ключевыми факторами: концентрацией целевых соединений в образце, типом матрицы и её химическим составом.
Особенно важным аспектом является необходимость высокой избирательности и чувствительности методов при speciation-анализе. Это связано с
тем, что исследуемые формы обычно представлены в минимальных количествах по сравнению с общим содержанием вещества. Наиболее распространённые методы, сочетающие высокую селективность и чувствительность, можно условно разделить на две разновидности: атомную спектрометрию и масс-спектрометрию. В современных лабораториях преобладают спектрометры с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС), оснащённые квадрупольным анализатором масс. Однако использование таких систем может быть осложнено спектральными помехами, вызванными наличием изобарных или полиатомных частиц в плазме. Для минимизации этих негативных эффектов применяются специальные универсальные технологии, такие как динамическая реакционная камера, холодная плазма или удаление примесей растворителя. Благодаря исключительно низкому пределу обнаружения, а также способности эффективно обрабатывать большие объемы проб, ИСП-МС стал одним из основных инструментов для анализа микроэлементов в различных средах, включая биологические матрицы. Высокая производительность и возможность одновременного определения множества элементов в одну серию делают этот метод особенно ценным в исследованиях, связанных с выявлением следовых количеств металлов.
Атомная спектрометрия подразделяется на АФС, ААС и АЭС (или ОЭС), среди которых АФС является наиболее часто используемым методом и представляет собой подходящую альтернативу другим атомным спектрометрическим и масс-спектрометрическим методам (Clough et al., 2018). Прямая связь между высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) и детекторами, вероятно, будет нарушаться из-за помех, создаваемых матрицами образцов. Следовательно, когда АФС используется для детектирования изоформ As, Se, Sb и Hg, метод ртутного гидрирования (РГ) для As, Se, Sb и получения холодного пара (ХП) для РГ обычно применяется в качестве оперативного метода постколоночной дериватизации для выделения анализируемых веществ из матриц образцов. Интеграция РГ/ХП основана на реакции BH4 – с обработанным кислотой образцом перед детектором, что является эффективной превентивной мерой для уменьшения помех и фонового сигнала от нативной матрицы. Пределы обнаружения ниже, чем микрограмм на литр, были получены с использованием ВЭЖХ-РГ-АФС для анализа As (Grijalba et al., 2016). Однако следует отметить, что переходные металлы, присутствующие в образцах, могут вызвать серьезные помехи в процессе определения. В (Xi et al., 2015) изложены некоторые предложения по улучшению измерений. Следовательно, требуется предварительная обработка для получения соединений с более низкой валентностью, то есть As(V), As(III), Sb(V), Sb(III) и Se(VI), Se(IV). Например, As(V) обладает низкой эффективностью по ртути, поэтому для улучшения аналитических свойств, использовали кислый раствор тиомочевины в режиме реального времени (Yu et al., 2016). Однако изза разных химических свойств каждого элемента и связанных с ним соединений реакционная способность этих соединений сильно различается. Например, KI может восстанавливать As(V) и Sb(V) до As(III) и Sb(III) при комнатной температуре, в то время как при тех же условиях невозможно восстановить Se(VI) до Se(IV).
Неоспоримыми преимуществами ИСП-МС перед другими детекторами биологических видов являются его высокая чувствительность и возможность мультиэлементного оперативного обнаружения. Кроме того, применение МС-анализа позволяет не только получить информацию о качественном и количественном составе пробы, но и определить структуру и молярные массы анализируемых веществ. Сочетание различных методов разделения с ИСП-МС стало общепринятой практикой для анализа следовых количеств As, Hg, Se и Sb (Marcinkowska, Baralkiewicz, 2016). В отличие от РГ/ХП-АФС, для ИСП-МС не требуется стадий окисления и предварительного восстановления, если только РГ не является внедренным в систему. Несмотря на то, что интерфейс ИСП-МС детектора с ВЭЖХ относительно прост, основная проблема заключается в том, что используемая подвижная фаза должна быть совместима с системой детектирования. Подвижные фазы натриевого или калийно-фосфатного буфера, часто используемые в IEC (IEC − International Electrotechnical Comission), не подходят для МС детектора. Нелетучие буферные соли могут накапливаться на линзах и конусах-скиммерах, что приводит к смещению сигнала и высокому уровню технического обслуживания для очистки внутренних поверхностей МС-детектора, следовательно, для использования требуются летучие буферные системы или системы с низким содержанием остатков (Zhao et al., 2018). Органические модификаторы часто применяются в подвижной фазе обращённофазной хроматографии, и большие объемы органического растворителя, попадающие в ИСП, вероятно, приводят к нестабильной плазме.
Несмотря на то, что ИСП-МС обладает очень хорошими аналитическими характеристиками для определения ультрадисперсных значений, одним из его недостатков является то, что сигналы молекулярных ионов могут подвергаться помехам, создаваемым атомарным аргоном (Ar) и хлором (Cl), которые могут препятствовать измерению содержания Se и As. Например, когда ИСП-МС используется в качестве детектора для определения As, он часто сильно искажается от хлоридных помех, если образцы содержат большое количество хлоридов, поскольку образуются 38Ar 37Cl+, 40Ar 35Cl+ (m/z 75 совпадает с 75As) (Stiboller et al., 2017). С введением дополнительного квадруполя ИСП-тандем МС (ИСП-МС/МС) обеспечивает больше режимов реакции/столкновения для устранения помех (Bolea-Fernandez et al., 2017). ИСП-МС/МС можно рассматривать как обычный модуль ИСПCRC-МС (с ячейкой соударений) с дополнительным квадруполем, расположенным перед CRC. В CRC могут попадать только ионы с заданным соотношением m/z, что способствует лучшему контролю за реакциями, происходящими в клетке-ячейке.
Качество обнаружения МС позволяет использовать анализ изотопного разбавления для вещественного анализа благодаря его специфическому определению, основанному на соотношении m/z (Rodriguez-Gonzalez, Alonso, 2010).ИР-МС считается эффективным методом, предлагающим точное определение видов элементов с небольшими погрешностями в изотопном соотношении. Например, для количественного определения содержания Se в сыворотке крови и моче человека Jeong и соавт. (Jeong et al., 2016) использовали изотопное разбавление 78Se после анализа на колонке. Анализ неорганических соединений Se(VI) и Se(IV) методом РГ должен проводиться путем предварительного определения Se(IV) и последующего преобразования Se(VI) в Se(IV) перед каждым определением. Между тем стабильность плазмы, определяемая методом РГ-ИСП-МС, может ухудшиться, поскольку система РГ в режиме реального времени подает в ИСП не только пары гидрида, но и большое количество водорода. Поэтому активно разрабатываются другие альтернативные методы получения пара, например, онлайн последовательный фотокатализатор, с помощью которого устройство для расщепления и испарения было подключено к LC и ИСП-МС по Tsai et al. (Tsai et al., 2014) для анализа форм Se. Внедрение speciation-анализа в биомедицинскую практику для ранней диагностики сталкивается с фундаментальными техническими
сложностями уже на начальном этапе. Ключевой задачей становится выбор оптимальной методики и оборудования. Пути решения включают как масштабирование и модификацию существующих программ, так и применение инновационных подходов, например использования уникальных наноматериалов для повышения эффективности детектирования.
Исследование химических форм микроэлементов (speciation-анализ) активно трансформируется в области медицинской элементологии, что подтверждается современными работами, применяющими комплексные подходы к изучению биосубстратов человека, таких как волосы и сыворотка крови. Для повышения точности результатов используются комбинированные методы, например, индуктивно-связанная плазменная массспектрометрия (ИСП-МС) и атомно-эмиссионная спектроскопия (АЭС), которые независимо верифицируют содержание элементов. Интеграция оборудования, например, объединение хроматографических систем с детекторами, не только упрощает процессы анализа, но и снижает затраты
на поддержание лабораторных условий.
Работы А.В. Скального с соавт. (Скальный и др., 2003; Айсувакова, Скальный, 2018; Skalny et al., 2021; 2022) демонстрируют применение ИСПМС для детекции в сочетании с гель-фильтрацией и ВЭЖХ для изучения распределения металлов в сыворотке. Установлено, что использование десферриоксамина, связывающего железо, вызывает дисбаланс микроэлементов, особенно выраженный
относительно цинка. Также зафиксировано увеличение концентраций марганца, меди и цинка. Анализ связывания меди показал, что её основная часть не ассоциируется с церулоплазмином или макроглобулинами, а вклад альбумин-связанной меди оказался минимальным. Низкомолекулярные комплексы, включая аминокислотные соединения, составили незначительную долю. В случае цинка ключевые фракции были идентифицированы как связанные с α2-макроглобулином и альбумином. Примечательно, что в сыворотке цинк преимущественно находился в аминокислотных комплексах, тогда как для меди эта фракция была менее выраженной. Полученные данные открывают новые перспективы для оценки биодоступности микроэлементов в диетах. Дальнейшее развитие speciation-анализа и металломики требует активного междисциплинарного взаимодействия. Ключевую роль играет объединение усилий экологов, токсикологов, специалистов по профессиональной патологии и биохимиков. Именно их совместный интерес и запросы способны стимулировать аналитиков к разработке более совершенных методик. Такая синергия является залогом новых открытий в понимании роли химических форм элементов в живых системах и их применения в биомедицинской диагностике.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Точная идентификация и классификация химических форм элементов в исследуемых образцах критически важна для корректной обработки данных и построения аналитической матрицы. Это основа достоверного анализа. Современная наука демонстрирует значительные успехи в исследовании химических форм микроэлементов в биологических объектах, и прогресс обусловлен развитием гибридных технологий, интегрирующих методы высокоэффективного разделения с высокоспецифичным детектированием (масс-спектрометрия, атомная спектроскопия). Такая интеграция позволяет глубже исследовать сложные биологические
системы и открывает новые возможности в экологии, медицине, биохимии и токсикологии. Особую ценность эти методы представляют для изучения металлоорганических соединений и их функций в живых организмах.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Айсувакова О.П., Скальный А.В. Применение масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой для speciationанализа соединений мышьяка и ртути в волосах человека. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2018; 21(7): 36. [Ajsuvakova O.P., Skalny A.V. Primenenie mass-spektrometrii s induktivno svyazannoj plazmoj dlya speciation-analiza soedinenij mysh'yaka i rtuti v volosah cheloveka. Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii. 2018; 21(7): 36. (In Russ.)].
Скальный А.В. и др. Комплексный подход к элементному анализу волос с использованием методов ИСП-АЭС и ИСПМС. Микроэлементы в медицине. 2003. 4(1): 41–46. [Skalny A.V. i dr. Kompleksnyj podhod k elementnomu analizu volos s ispol'zovaniem metodov ISP-AES i ISP-MS. Mikroelementy v medicine. 2003. 4(1): 41–46. (In Russ.)].
Bolea-Fernandez E., Balcaen L., Resano M., Vanhaecke F. Overcoming spectral overlap via inductively coupled plasmatandem mass spectrometry (ICPMS/MS). A tutorial review. J. Anal. Atom. Spectrom. 2017; 32: 1660–1679.
Clough R., Harrington C.F., Hill S.J., Madrid Y., Tyson J.F. Atomic spectrometry update: Review of advances in elemental speciation. J. Anal. Atom. Spectrom. 2018; 33: 1103–1149.
Grijalba A.C., Fiorentini E.F., Martinez L.D., Wuilloud R.G. A comparative evaluation of different ionic liquids for arsenic species separation and determination in wine varietals by liquid chromatography-hydride generation atomic fluorescence spectrometry. J. Chromatogr. A. 2016; 1462: 44–54.
Jeong J.S., Lee J., Park Y.N. Quantitative speciation of selenium in human blood serum and urine with AE-RP- and AFHPLC-ICP/MS. Bull. Korean Chem. Soc. 2016; 34: 3817–3824.
Marcinkowska M., Baralkiewicz D. Multielemental speciation analysis by advanced hyphenated technique—HPLC/ICP-MS: A review. Talanta. 2016; 161: 177–204.
Rodriguez-Gonzalez P., Alonso J.I.G. Recent advances in isotope dilution analysis for elemental speciation. J. Anal. Atom. Spectrom. 2010; 25: 239–259.
Skalny A.V. et al. Alteration of iron (Fe), copper (Cu), zinc (Zn), and manganese (Mn) tissue levels and speciation in rats with desferioxamine-induced iron deficiency. Biometals. 2021; 34(4): 923–936.
Skalny A.V. et al. Speciation of serum copper and zinc-binding high-and low-molecular mass ligands in dairy cows using HPLC-ICP-MS technique. Biological Trace Element Research. 2022; 200(2): 591–599.
Stiboller M., Raber G., Gjengedal E.L.F., Eggesbo M., Francesconi K.A. Quantifying inorganic arsenic and other watersoluble arsenic species in human milk by HPLC/ICPMS. Anal. Chem. 2017; 89: 6266–6272.
Tsai Y.N., Lin C.H., Hsu I.H., Sun Y.C. Sequential photocatalyst-assisted digestion and vapor generation device coupled with anion exchange chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry for speciation analysis of selenium species in biological samples. Anal. Chim. Acta. 2014; 806: 165–171.
Xi J.C., He M.C., Wang K.P., Zhang G.Z. Comparison of masking agents for antimony speciation analysis using hydride generation atomic fluorescence spectrometry. Front. Environ. Sci. Eng. 2015; 9: 970–978.
Yu X.P., Deng T.L., Guo Y.F., Wang Q. Arsenic species analysis in freshwater using liquid chromatography combined to hydride generation atomic fluorescence spectrometry. J. Anal. Chem. 2016; 69: 83–88.
Zhao F., Liu Y.M., Zhang X.Q., Dong R., Yu W.J., Liu Y.F., Guo Z.M., Liang X.M., Zhu J.H. Enzyme-assisted extraction and liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry for the determination of arsenic species in fish. J. Chromatogr. A. 2018; 1573: 48–58.
Информация об авторе:
Дмитрий Михайлович Ляпуновский – аспирант, стажер-исследователь, НИИ Молекулярной и клеточной медицины, Медицинский институт;
ведущий химик-аналитик;
ORCID: 0009-0003-4863-1792