ОЦЕНКА ЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА СЕМЕННОЙ ПЛАЗМЫ ПРИ ИДИОПАТИЧЕСКОМ МУЖСКОМ БЕСПЛОДИИ

РЕЗЮМЕ. Цель исследования – изучение элементного состава спермоплазмы у мужского населения Севера для оценки его роли в риске развития таких видов патоспермии, как олигозооспермия, астенозооспермия, тератозооспермия и олигоастенотератозооспермия (ОАТ-синдром), при идиопатическом мужском бесплодии. 

Материалы и методы. Анализ элементного состава спермоплазмы выполняли методом массспектрометрии с индуктивно-связанной плазмой. 

Результаты. Установлено, что содержание таких эссенциальных химических элементов, как калий, магний, фосфор, цинк, медь и селен оказалось ниже границы физиологически оптимальных значений в группе мужчин с идиопатическим бесплодием, а также у мужчин, реализовавших свою репродуктивную функцию. При этом концентрации фосфора (p=0,008), меди (p=0,047) и селена (p<0,001) были достоверно ниже в группе пациентов с идиопатическим мужским бесплодием, чем в группе мужчин с реализованной репродуктивной функцией. Вместе с тем значимых различий между уровнями калия, магния и цинка в семенной плазме мужчин обследуемых групп выявлено не было. Средние величины содержания кальция, железа и марганца в сравниваемых группах расположились в пределах референсных значений, при этом уровень марганца у пациентов основной группы был на нижней границе нормы, а уровень железа (p=0,02) оказался на 70% ниже, чем у мужчин контрольной группы. Концентрации токсичных элементов: ртути, свинца и кадмия, в обеих группах не превышали верхнюю границу нормы. 

Заключение. Полученные данные указывают на необходимость заблаговременной фармаконутрицевтической коррекции элементного статуса у мужского населения Севера для предупреждения бесплодия, а также в персонализированной и комплексной оценке обмена химических элементов у мужчин с идиопатическим бесплодием для повышения эффективности лечения. 

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: элементный статус, идиопатическое мужское бесплодие, патоспермия, спермоплазма, Север.  

Для цитирования: Белик О.С., Корчин В.И. Оценка элементного состава семенной плазмы при идиопатическом мужском бесплодии. Микроэлементы в медицине. 2024;25(4):31−40. DOI: 10.19112/2413-6174-2024-25-4-31-40. 

ВВЕДЕНИЕ
Существующий в Российской Федерации демографический кризис имеет в своей основе многофакторные причины, ведущее место среди которых занимает рост числа бесплодных пар, частично или полностью связанный с мужским фактором примерно в 50% случаев (Agarwal et al., 2021). По данным официальной статистики, количество бесплодных мужчин в нашей стране за два последних десятилетия увеличилось на 114%. При этом общее число зарегистрированных случаев мужского бесплодия в России значительно ниже мировых данных, что является свидетельством отсутствия подлинной информации об этом заболевании, связанном с ненадлежащим вниманием к данной проблеме (Лебедев и др., 2019). На сегодняшний день общепризнанными причинами мужского бесплодия являются врожденные или приобретенные нарушения развития мочеполовых органов, злокачественные опухоли, инфекционно-воспалительные заболевания мочеполовой системы, повышение температуры в мошонке (например, при варикоцеле), эндокринные нарушения, генетические отклонения, иммунологические факторы и нарушения эрекции или эякуляции. В остальных случаях мужское бесплодие считается идиопатическим, то есть это такая форма бесплодия, при которой четко определяемая причина нарушения репродуктивной функции отсутствует (Клинические рекомендации «Мужское бесплодие», 2021).

К факторам, которые могут оказывать негативное влияние на репродуктивную систему мужчин и быть потенциальными причинами идиопатического бесплодия, относят: «старший отцовский возраст»; коморбидные состояния; нарастающее загрязнение среды обитания; обстоятельства, негативно влияющие на эмоциональное здоровье; низкий уровень физической активности; употребление алкоголя, табака, некачественных продуктов питания; воздействие на репродуктивную систему некоторых лекарств; профессии, связанные с тяжелыми условиями труда; неблагоприятные климатогеографические условия проживания; нарушения витаминно-минерального гомеостаза и др. (Литвинова и др., 2021).

 Основным и обязательным методом оценки фертильности мужчин является спермограмма, поскольку этот анализ дает информацию о функционировании всех элементов репродуктивной системы. Мужчины с нормальными показателями спермограммы могут оказаться бесплодными вследствие функциональных нарушений сперматозоидов (оксидативного стресса, нарушения акросомной реакции и капацитации, фрагментации ДНК сперматозоидов, незрелостью хроматина, антиспермальными антителами и др.), диагностируемых при помощи специальных тестов. Вместе с тем спермограмма позволяет выявить такие важные отклонения показателей эякулята, как олигозооспермия (снижение концентрации сперматозоидов), астенозооспермия (снижение подвижности сперматозоидов) и тератозооспермия (снижение количества морфологически нормальных сперматозоидов). В подавляющем большинстве случаев именно эти нарушения диагностируются у мужчин с идиопатическим бесплодием (World Health Organization, 2021).

Сперма человека содержит калий, кальций, магний, фосфор, железо, цинк, медь, селен марганец и другие химические элементы, влияющие на репродуктивное здоровье мужчины. Согласно современным данным, отклонения элементного гомеостаза в семенной плазме способны привести к идиопатическому мужскому бесплодию вследствие снижения концентрации, подвижности, нормальной морфологии и жизнеспособности сперматозоидов, нарушения их оплодотворяющей способности и генетических дефектов, а также других факторов, препятствующих нормальному формированию, развитию и имплантации эмбриона (Меленевский и др., 2019; Chao HH et al., 2023).

Районы Крайнего Севера и приравненные к ним местности, являющиеся дискомфортной для проживания территорией вследствие неблагоприятных климатогеографических условий, занимают примерно 70% территории России, где на начало 2023 г. проживало около 9,5 млн человек. Репродуктивная система реагирует на неблагоприятные условия окружающей среды формированием ряда адаптивных реакций, которые при дезадаптации, в том числе и по причине дефицита эссенциальных химических элементов или избыточного поступления тяжелых металлов, могут приводить к патологическим состояниям, что имеет важнейшее значение для жителей Севера (Скальный, 2018; Бикбулатова и др., 2021; Корчина и др., 2022).

Несмотря на наличие в литературе многочисленных сведений о негативном влиянии отклонения элементного гомеостаза в семенной плазме на мужскую фертильность, имеющиеся данные противоречивы и неоднородны. Кроме того, в северных регионах эта проблема остается изученной крайне неосновательно.

Цель исследования – изучение элементного состава спермоплазмы у мужского населения Севера для оценки его роли в риске развития таких видов патоспермии, как олигозооспермия, астенозооспермия, тератозооспермия и олигоастенотератозооспермия (ОАТ-синдром), при идиопатическом мужском бесплодии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 
Проведенное исследование соответствует стандартам Хельсинской декларации, одобрено локальным этическим комитетом (ЛЭК) БУ «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия», протокол № 174 от 16.11.2021 г.

В исследовании приняло участие 102 мужчин, проживающих в районах Крайнего Севера и приравненных к ним местностям не менее 5 лет. Обследуемые лица были распределены на две группы: основную (I) и контрольную (II). Основную группу составили 58 мужчин с патоспермией (олигозооспермией, астенозооспермией, тератозооспермией, ОАТ-синдромом), состоящих в бесплодном браке не менее 12 месяцев. В группу контроля вошли 44 мужчины с реализованной репродуктивной функцией и нормоспермией на момент исследования. 

Основные критерии включения мужчин в исследование: проживание в северном регионе более 5 лет; возраст 20–45 лет; добровольное информируемое согласие, оформленное в письменном виде и одобренное решением ЛЭК.

Критерии исключения из исследования: варикозное расширение вен лозовидного сплетения; эндокринные заболевания; инфекционновоспалительные заболевания мочеполовой системы; наличие инфекций репродуктивного тракта (Chlamidia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma spp., Ureaplasma spp., Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis); пороки развития мочеполовой системы; иммунологическое бесплодие; соматические заболевания, влияющие на фертильность; наличие общих заболеваний в острой фазе или хронических в фазе обострения; патоспермия в виде олигоспермии, вискозипатии, азооспермии, криптозооспермии, гемоспермии и лейкоцитоспермии; прием пищевых добавок, содержащих микроэлементы в течение последних 6 месяцев; отказ от включения в исследование.

Сбор спермы осуществляли согласно рекомендациям ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека (2010). Образцы эякулята обследуемые мужчины сдавали в специализированной комнате лаборатории путем мастурбации в стерильные пластиковые контейнеры в утренние часы. Средний период воздержания от половых контактов для мужчин обеих групп при оценке показателей эякулята (спермограмме) составил 4±0,1 дня. После полного разжижения эякулята при соблюдении 37 °C в течение 20–60 мин проводиды его анализ на автоматическом анализаторе Sperm Quality Analyzer (SQA-V) фирмы Medical Electronic Systems (Израиль). Полученные образцы эякулята подвергали центрифугированию при 3000 об/мин в течение 25 мин. Полученную надосадочную жидкость (спермоплазму) собирали в пробирки типа эппендорф, маркировали и хранили при температуре –80 ºС. Размораживание выполняли однократно непосредственно перед анализом.

Элементный состав спермоплазмы анализировали в лаборатории АНО «Центр биотической медицины», аккредитованной в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии (аттестат аккредитации РОСС RU.0001.22ПЯ05), методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС) на приборе NexION 300D (PerkinElmer Inc., Shelton, CT, США), оснащенном автоматическим многоканальным дозатором ESI SC-2 DX4 (Elemental ScientificInc, Omaha, NE, США). Определяли концентрацию 12 элементов: 9 эссенциальных – калия (K), кальция (Ca), магния (Mg), фосфора (P), железа (Fe), цинка (Zn), меди (Cu), селена (Se), марганца (Mn) и 3 токсичных – ртути (Hg), свинца (Pb), кадмия (Cd). Полученные результаты сопоставляли с референтными значениями (Скальный, 2004).

Статистическую обработку проводили с использованием программы Statistica 13.3 (TIBCO Software Inc, США). Вычисляли среднее арифметическое значение (М), среднеквадратическое отклонение (σ), медиану (Me), а с учетом непараметрического распределения числовых значений использовали 25-й и 75-й перцентили. Статистическую значимость различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали статистически значимыми при p <0,05. 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Обследуемые лица в обеих группах были сопоставимы по возрасту, росту и массе тела (табл. 1 "Характеристика пациентов исследуемых групп" в приложенном pdf-файле). При этом индекс массы тела (ИМТ) оказался достоверно выше в группе мужчин с идиопатическим бесплодием (p <0,001).

В табл. 2 ("Элементный состав семенной плазмы пациентов исследуемых групп (мкг/проба)" в приложенном pdf-файле)представлены результаты элементного состава семенной плазмы мужчин исследуемых групп. Анализ полученных результатов позволил установить, что средние величины (М, Ме) содержания таких жизненно важных химических элементов, как калий, магний, фосфор, цинк, медь и селен оказались ниже границы физиологически оптимальных значений, как в основной группе, так и в группе контроля. При этом концентрации фосфора (p=0,008), меди (p=0,047) и селена (p<0,001) достоверно ниже в группе пациентов с идиопатическим мужским бесплодием, чем в группе мужчин с реализованной репродуктивной функцией. Следует отметить, что значимых различий между уровнями калия, магния и цинка в семенной плазме у мужчин обследуемых групп выявлено не было.

Нелишне подчеркнуть, что хотя средние значения содержания кальция, железа и марганца в исследуемых группах расположились в границах физиологически оптимальных величин, уровень марганца у пациентов группы I был приближен к нижней границе нормы, а уровень железа (p=0,02) оказался достоверно выше в группе II.

Наряду с уровнем эссенциальных элементов в семенной плазме мужчин с идиопатическим бесплодием и реализованной репродуктивной функцией, были установлены паттерны кумуляции таких токсичных элементов, как ртуть, свинец и кадмий. Несмотря на то, что в обеих исследуемых группах средние величины показателей концентрации всех трех токсичных элементов расположились до верхней границы нормы, нельзя не отметить, что уровни содержания ртути и свинца у нескольких пациентов из основной группы превысили предел нормы. 

Следует отметить, что только в комплексе с такими биологическими образцами как кровь, волосы можно судить о наличии дисбаланса химических элементов в организме. Подобные исследования были проведены авторами ранее. В табл. 3 и 4 ( в приложенном pdf-файле) представлена достоверная информация о снижении уровня цинка, селена (как антиоксидантов) и возрастании концентрации ртути и свинца (в волосах). Наличие токсичных микроэлементов указывает на то, что при дефиците селена, который является антагонистом ртути, возрастает ее количество. Также на содержание токсичных микроэлементов влияет преобладание в рационе питания к речной рыбы, которая аккумулирует данный химический элемент из-за выбросов нефтеперерабатывающих предприятий в водоемы. Что касается цинка, то при его хроническом дефиците возрастает количество свинца как антагониста.

Результаты проведенного исследования позволили установить нарушения обмена эссенциальных элементов в репродуктивной системе мужчин, проживающих на Севере. Снижение уровня калия, магния, фосфора, цинка, меди и селена являлось общим нарушением как для бесплодных, так и для фертильных мужчин. При этом особенно явные нарушения, проявляющиеся более выраженным снижением уровней фосфора и меди, наблюдались в группе мужчин с идиопатическим бесплодием. Выявленные закономерности у мужского населения Севера согласуются с результатами ранее проведенных исследований, свидетельствующих о наличии дефицита микронутриентов у жителей северных регионов России (Лапенко и др., 2021). При этом, несмотря на показанное в этой работе снижение содержания кальция, железа и марганца у людей, проживающих на Севере, а также в ряде научных трудов (Maciejewski et al., 2022; Chao H-H et al., 2023), свидетельствующих о снижении этих химических элементов в эякуляте бесплодных мужчин, в нашем исследовании уровни кальция, железа и марганца оказались в пределах физиологически оптимальных значений как в группе пациентов с идиопатическим бесплодием, так и в группе мужчин с реализованной репродуктивной функцией. Заслуживает внимания тот факт, что уровень марганца у бесплодных мужчин находится на нижней границе нормы, а уровень железа в семенной плазме бесплодных мужчин на 70% ниже, чем таковой у фертильных. Вместе с тем в отдельных исследованиях рассматривалась взаимосвязь между нарушениями обмена макро- и микроэлементов и патоспермией как одной из основных причин мужского бесплодия. Известно, что калий напрямую связан с подвижностью сперматозоидов, играет важную роль в капацитации и регуляции их мембранного потенциала, а соответственно оказывает влияние на способность мужских половых клеток к оплодотворению. Дефицит этого элемента в сперме может приводить к мужскому бесплодию, что подтверждается исследованием ученых из Канзаса, демонстрирующим что отсутствие Na+ /K+ аденозинтрифосфатазы – фермента, в норме в изобилии присутствующего в средней части жгутиков мужских половых клеток, приводит к потере способности сперматозоидов оплодотворять яйцеклетки in vitro (Jimenez et al., 2011).

Магний – важный микроэлемент и активатор многих ферментов реакции переноса фосфора; он участвует в сперматогенезе и влияет на подвижность сперматозоидов, так как энергия, необходимая для подвижности сперматозоидов, высвобождается магнийзависимой аденозинтрифосфатазой (Pascoal et al., 2022). Обычно биологическое действие магния тесно связано с кальцием. Так, снижение уровня магния приводит к сужению сосудов из-за повышения уровня тромбоксана, увеличения внутриклеточного Ca2+ в эндотелии и снижения концентрации оксида азота, что может приводить к нарушению гемоциркуляторных процессов в органах мошонки и соответственно способствовать снижению мужской фертильности (Liang et al., 2016).

Роль фосфора в сперме человека на сегодняшний день не установлена. В то же время замечено, что фосфор обеспечивает функциональную состоятельность добавочных желез половой системы, а его содержание положительно коррелирует с концентрацией фруктозы в семенной жидкости (Banjoko et al., 2013).

В настоящее время роль цинка в нормальном функционировании мужской репродуктивной системы считается доказанной. Этот микроэлемент участвует в развитии яичек, стероидогенезе, превращении тестостерона в 5aдигидротестостерон, конденсации и стабилизации хроматина сперматозоидов, акросомной реакции, активности акрозина. От цинка зависят многие биохимические механизмы, поскольку он действует как кофактор для более чем 200 ферментов, включая те, которые принимают участие в транскрипции ДНК, синтезе белка и антиоксидантной защите (Осадчук и др., 2021; Maciejewski et al., 2022; Божедомов и др., 2023).

Медь является компонентом многих металлоферментов, обладающих окислительновосстановительной активностью, присутствуя в семенной плазме в нормальной концентрации, защищает сперматозоиды от окислительного повреждения (Карнаухова и др., 2018). В то же время установлено, что воздействие высоких доз меди отрицательно коррелирует с концентрацией, подвижностью, жизнеспособностью и целостностью акросом сперматозоидов (Hardneck et al., 2021).

Селен является важным химическим элементом, участвующим в антиоксидантных реакциях и необходимым для нормального развития яичек, сперматогенеза и процесса конденсации хроматина сперматозоидов (Asri-Rezaei S. et al., 2018). Целый ряд исследований демонстрирует, что селен сам по себе или в комбинации с другими антиоксидантами может улучшать концентрацию сперматозоидов, их подвижность и морфологию (Qazi et al., 2019).

Кальций регулирует сперматогенез, а также рост, дифференцировку и пролиферацию сперматогониев и сперматоцитов (Galpour et al., 2017). Кроме того, кальций действует как внутриклеточный вторичный мессенджер и участвует в различных клеточных функциях, включая гиперактивацию, капацитацию, акросомную реакцию и хемотаксис в женских репродуктивных путях (James et al., 2015).

Железо играет ключевую роль в синтезе нуклеиновых кислот и белков, клеточном дыхании, пролиферации и дифференцировке клеток и таким образом тесно связано с процессом сперматогенеза. Кроме того, железо участвует в поддержании нормальной вязкости и кислотности эякулята, а также является неферментативным антиоксидантом, защищающим сперматозоиды от пагубного воздействия свободных радикалов (Liu et al., 2022). Важность железа для мужской фертильности продемонстрирована в различных исследованиях in vivo и in vitro (Tvrda et al., 2015). В то же время супрафизиологические концентрации железа в семенной плазме приводят к усилению перекисного окисления липидов в плазматических мембранах и повреждению мужских половых клеток (Ненкова и др., 2017).

Считается, что марганец играет существенную роль в мужской фертильности. Этот химический элемент является частью митохондриальной Mn-содержащей супероксиддисмутазы – фермента, являющегося мощным антиоксидантом, защищающим митохондрии сперматозоидов от избыточного влияния свободных радикалов. Также он необходим для ангиогенеза, участвует в реализации вазодилатирующего каскада оксида азота, а также входит в состав металлоферментов – аргиназы, гуанилат-циклазы, холинэстеразы и других (Воронцова и др., 2020). Марганец как кофактор мевалонаткиназы и фарнезилпирофосфатсинтазы участвует в синтезе холестерина, который является предшественником половых гормонов, и таким образом также влияет на фертильность (Xie et al., 2014). В ряде исследований показано, что дефицит марганца вызывает репродуктивные нарушения, однако следует подчеркнуть, что положительное влияние этого элемента на фертильность проявляется только при его физиологическом уровне, в то время как в супрафизиологических концентрациях он токсичен (Maciejewski et al., 2022).

Загрязнение окружающей среды и воздействие тяжелых металлов становятся все более серьезными проблемами в мире. Некоторые тяжелые металлы в высоких концентрациях могут оказывать значительное негативное влияние на мужскую репродуктивную систему, что находит свое подтверждение в многочисленных исследованиях на животных и людях (Manouchehri el al., 2022). Причем для таких металлов, как ртуть, свинец и кадмий, доказательства такого влияния более убедительны, чем для остальных тяжелых металлов. Однако механизмы, приводящие к такого рода эффектам, остаются недостаточно изученными (Переломов и др., 2016).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное исследование выявило высокий риск развития дефицита эссенциальных химических элементов в эякуляте у мужчин, проживающих в северных регионах, более выраженный у пациентов с идиопатическим бесплодием. Заслуживает внимание значимое снижение уровней меди и особенно селена, которые проявляют свойства антиоксидантов и могут быть причиной развития окислительного стресса. Данное наблюдение является свидетельством необходимости поддержания элементного гомеостаза в репродуктивной системе для сохранения мужской фертильности.

С практической точки зрения, выявленные особенности подчеркивают необходимость в проведении заблаговременной фармаконутрицевтической коррекции элементного статуса у мужского населения Севера для предупреждения бесплодия, а также в персонализированной и комплексной оценке обмена химических элементов у мужчин с идиопатическим бесплодием для повышения эффективности лечения.

 ЛИТЕРАТУРА
Бикбулатова Л.Н. Элементный статус взрослого населения Ямало-Ненецкого автономного округа. Журнал медикобиологических исследований. 2021; 3: 248−257.
Божедомов В.А., Кононенко И.А. Преконцепционная подготовка мужчин: роль питания и комплексов нутриентов. Часть 1 Экспериментальная и клиническая урология. 2023; 16 (1): 128−137.
 Воронцова А.В., Гаспарян С.А., Громова О.А., Джобава Э.М., Киселева Е.Ю., Коротких И.Н., Кулешов В.М., Обоскалова Т.А., Пустотина О.А., Сахаутдинова И.В., Спиридонова Н.В., Тапильская Н.И., Тхостова Е.Б. Заключение совещания экспертов «Обоснование применения средств на основе инозитола у пациенток с нарушениями менструального цикла». Проблемы репродукции. 2020;26(1): 44−54.
Карнаухова И.В., Ширяева О.Ю. Исследование содержания меди и активности медь-зависимой супероксиддисмутазы в организме человека. Научное обозрение. Биологические науки. 2018; 2: 10−14.
Клинические рекомендации "Мужское бесплодие" (утв. Минздравом России). 2021; 27 с.
Корчина Т.Я., Терникова Е.М., Корчин В.И. Оценка обеспеченности биоэлементами, входящими в состав ферментативного звена антиоксидантной системы защиты, у пожилых жителей Ханты-Мансийского автономного округа. Микроэлементы в медицине. 2022; 23(1): 35−40.
Лапенко И.В. Особенности состояния метаболического профиля элементного и микронутриентного статуса у коренного и пришлого населения урбанизированного Севера. Воронеж: Издательство «Ритм». 2021; 316 с.
Лебедев Г.С., Голубев Н.А., Шадеркин И.А., Щадеркина В.А., Аполихин О.И., Сивков А.В., Комарова В.А. Мужское бесплодие в Российской Федерации: статистические данные за 2000-2018 годы. Экспериментальная и клиническая урология. 2019; 4: 4−13.
Литвинова Н.А., Лесников А.И., Толочко Т.А., Шмелев А.А. Эндогенные и экзогенные факторы, влияющие на мужскую фертильность. Фундаментальная и клиническая медицина. 2021; 6(2): 124−135.
Меленевский А.Д., Пыхтеева Е.Г., Костев Ф.И., Чайка А.М. Влияние элементного дисгомеостаза на фертильность спермы (обзор). Актуальные проблемы транспортной медицины. 2019; 4(58): 36−49.
Осадчук Л.В., Даниленко А.Д., Осадчук А.В. Влияние цинка на мужскую фертильность. Урология. 2021; 5: 84−93
Переломов Л.В., Переломова И.В., Веневцева Ю.Л. Токсическое влияние микроэлементов на репродуктивное здоровье. Физиология человека. 2016; 42(4): 120−129.
Скальный А.В. Микроэлементы. Изд. 4-е, переработанное. М.: «Фабрика блокнотов». 2018; 295 с.
Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине. Москва: Издательство «МИР». 2004; 272 с.
Agarwal A., Baskaran S., Parekh N., Cho C.L., Henkel R., Vij S., Arafa M., Panner Selvam M.K., Shah R. Male infertility. Lancet. 2021; 397(10271): 319–333.
Asri-Rezaei S., Nourian A., Shalizar-Jalali A., Najafi G., Nazarizadeh A., Koohestani M. Selenium supplementation in the form of selenium nanoparticles and selenite sodium improves mature male mice reproductive performances. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 2018; 21: 577–85.
Banjoko S.O., Adeseolu F.O. Seminal Plasma pH, Inorganic Phosphate, Total and Ionized Calcium Concentrations in The Assessment of Human Spermatozoa Function. Journal of clinical and diagnostic research. 2013; 7(11): 2483–2486
Chao H-H., Zhang Y., Dong P-Y., Gurunathan S., Zhang X-F. Comprehensive review on the positive and negative effects of various important regulators on male spermatogenesis and fertility. Frontiers in Nutrition. 2023; 9:1063510.
Golpour A., Psenicka M., Niksirat H. Subcellular distribution of calcium during spermatogenesis of zebrafish, Danio rerio. Morphol. 2017; 278: 1149–59.
Hardneck F., de Villiers C., Maree L. Effect of Copper Sulphate and Cadmium Chloride on Non-Human Primate Sperm Function in Vitro. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2021; 18: 6200.
James V., Kalanghot P.S., Pulikkal S.K., Kalanghot P.S.A., Skandhan A., Meenaxi G. Calcium and magnesium in male reproductive system and in its secretion. I level in normal human semen, seminal plasma and spermatozoa. Urologia. 2015; 82: 174–8.
Jimenez T., McDermott J.P., Sanchez G., Blanco G. Na,K-ATPase alpha4 isoform is essential for sperm fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2011; 108: 644−9.
Liu Y., Cao X., He C., Guo X., Cai H., Aierken A., Hua J., Peng S. Effects of Ferroptosis on Male Reproduction. International Journal of Molecular Sciences. 2022; 23(13): 7139
Liang H., Miao M., Chen J., Chen K., Wu B., Dai Q., Wang J., Sun F., Shi H., Yuan W. The Association Between Calcium, Magnesium, and Ratio of Calcium/Magnesium in Seminal Plasma and Sperm Quality. Biological trace element research. 2016; 174(1): 1−7.
Maciejewski R., Radzikowska-Buchner E., Flieger W., Kulczycka K., Baj J., Forma A., Flieger J. An Overview of Essential Microelements and Common Metallic Nanoparticles and Their Effects on Male Fertility. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2022; 19(17): 11066.
Manouchehri A., Shokri S., Pirhadi M., Karimi M., Abbaszadeh S., Mirzaei G., Bahmani M. The Effects of Toxic Heavy Metals Lead, Cadmium and Copper on the Epidemiology of Male and Female Infertility. JBRA assisted reproduction. 2022; 26(4): 627–630.
Nenkova G., Petrov L., Alexandrova A. Role of Trace Elements for Oxidative Status and Quality of Human Sperm. Balkan Medical Journal. 2017; 34: 343–348. 
Pascoal G.D.F.L., Geraldi M.V., Marostica M.R., Ong T.P. Effect of paternal diet on spermatogenesis and offspring health: focus on epigenetics and interventions with food bioactive compounds. Nutrients. 2022; 14: 2150
Qazi I.H., Angel C., Yang H., Zoidis E., Pan B., Wu Z., Ming Z., Zeng C.-J., Meng Q., Han H. Role of Selenium and Selenoproteins in Male Reproductive Function: A Review of Past and Present Evidences. Antioxidants. 2019; 8: 268.
Tvrda E., Peer R., Sikka S.C., Agarwal A. Iron and copper in male reproduction: a double-edged sword. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2015; 32: 3−16.
World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 6th ed edition. 2021; 276 p.
Xie J., Tian C., Zhu Y., Zhang L., Lu L., Luo X. Effects of inorganic and organic manganese supplementation on gonadotropin-releasing hormone-I and follicle-stimulating hormone expression and reproductive performance of broiler breeder hens. Poultry Science. 2014; 93: 959–969.