РЕЗЮМЕ.
Представлен анализ результатов исследования оценки биологического действия химических
соединений кобальта и меди на представителей структурного микробиома кишечника, ввыполненного на модели Enterococcus sp., Lactobacillus sp. и E. coli. Полученные данные свидетельствуют о высоком уровне толерантности исследуемых штаммов к химическим соединениям эссенциальных элементов в концентрациях от
0,125 М/л до 0,031 М/л. Выявлено выраженное пролонгирующее действие кобальта и меди на динамические
показатели роста. Однако уровень сорбции данных элементов незначителен и составляет в среднем 10,7% для
E. coli (Cu) и 8,3% для Lactobacillus sp. (Co). Экспериментально установлено, что численность популяции E. coli
имеет достоверно низкие значения на фоне интоксикации кобальтом – ниже на 25,27% (p<0,05). Увеличение
численности популяции клеток данного микроорганизма можно связать со снижением конкурентоспособности
за питательные вещества на фоне сокращения численности популяции других микроорганизмов, о чем свидетельствуют результаты подсчета Enterococcus sp.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: кобальт, медь, острая интоксикация, биоаккумуляция.
Для цитирования: Баранова А.П., Сальникова Е.В., Побилат А.Е., Сизенцов А.Н. Оценка степени влияния меди и кобальта на флору кишечника в модельных экспериментах in vivo и in vitro. Микроэлементы в медицине. 2024;25(3):23−25. DOI: 10.19112/2413-6174-2024-25-3-10.
ВВЕДЕНИЕ
Микробиом кишечника выполняет ключевую роль в метаболических и иммунологических процессах организма хозяина. В современной литературе представлены многочисленные данные об уникальных механизмах толерантности бактериальных клеток к действию тяжелых металлов и их биоаккумулирующих характеристик. Воздействие тяжелых металлов тесно связано с функцией и толерантностью кишечных микробов (Zhao et al., 2024; Arun et al., 2021).
Ц е л ь и с с л е д о в а н и я – оценить уровень толерантности отдельных представителей
нормофлоры кишечника крыс в отношении химических соединений меди и кобальта.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Модельный эксперимент состоял из двух взаимодополняющих блоков. На первом этапе проведена оценка уровня толерантности к металлам тестируемых штаммов (Enterococcus sp., Lactobacillus sp. и E. coli), выделенных из структурного микробиома кишечника и дифференцированных с использованием микроскопических, культуральных и биохимических методов исследования. Полученные данные свидетельствуют о выраженной устойчивости тестируемых штаммов к исследуемым химическим соединениям меди и кобальта. В частности, установлено, что для Lactobacillus sp. минимальные ингибирующие концентрации (МИК) составляют 0,125 М/л (CoSO4) и 0,031 М/л (CuSO4),
Enterococcus sp. 0,063 (CoSO4) и 0,031 М/л (CuSO4) в отличии от изолята E. coli, для которого устойчивость имеет обратную картину, характеризующуюся более высокими показателями к исследуемым
химическим соединениям. Так, МИК составила для CuSO4 0,125 М/л, а для CoSO4 – 0,063 М/л.
Второй этап в реализации данного блока базировался на оценке степени влияния исследуемых
химических соединений на изолированные культуры клеток. Для реализации использовали нефелометрический метод. Динамику роста определяли методом интервального замера (каждые 3 ч) оптической плотности популяции исследуемых микроорганизмов до получения индетичных показателей (не
менее трех), свидетельствующих о выходе роста на максимальную фазу. Полученные данные свидетельствуют о значительной степени влияния исследуемых веществ на динамические показатели роста
популяции в условиях периодического культивирования. Установлено, что присутствие в субстрате CoSO4 оказывает пролонгированное действие на длительность экспоненциальной фазы E. coli с увеличением времени наступления стационарной фазы на 3 ч, при этом плотность популяции уступала
интактному показателю 5,86% (p<0,05). Для Enterococcus sp. время выхода на стационарную фазу
приходится на 30-й час проведения замеров, что на 6 ч больше по отношению к контролю, при этом
плотность популяции снижена на 42,95% (p<0,001). Lactobacillus sp. имеет схожую с E. coli характеризующуюся увеличение логарифмической фазу роста на 3 ч (36 ч контроль и 39 ч опыт) и уступает в
показателях оптической плотности 11,41% (p<0,05). В отношении CuSO4 у всех тестируемых штаммов регистрируется схожая картина с CoSO4 по динамике и времени наступления стационарной фазы
роста. Разница в показателях оптической плотности составила для Enterococcus sp. 26,32% (p<0,01),
Lactobacillus sp. 12,28% (p<0,05) ниже интактных значений, а для E. coli данный показатель составил
5,72% (p<0,05) в сторону увеличения.
Анализ сорбционной емкости исследуемых микроорганизмов проводили с использованием
атомно-абсорбционной спектрофотометрии. Анализировали биомассу клеток и супернатант с определение процента содержания элементов. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о
низком потенциале сорбции кобальта из субстрата всеми тестируемыми микроорганизмами. Уровень
аккумуляции составил 8,3% для Lactobacillus sp., 5,7% для Enterococcus sp. и 4,8% E. coli соответственно. В отношении накопления биомассой меди наблюдается обратная картина. Так, максимальные значения регистрируются у E. coli и составляют в среднем 10,7%, а минимальные значения регистрируются у Lactobacillus sp. и составляют 3,2%.
В модельном эксперименте in vivo были сформированы две группы аналогов из самцов крыс
Wistar по 15 голов в каждой. Животным натощак перорально вводили растворы CoSO4 и CuSO4 в дозах в пересчете на Co мг/кг массы тела и Cu 50 мг/кг соответственно. После создания острой интоксикации проводили оценку степени влияния исследуемых металлов на микрофлору кишечника на
модели Enterococcus sp. (тонкий отдел кишечника) и E. coli (толстый отдел). Высев и подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) проводили с интервалом в 2 ч (фоновое исследование, 2, 4, 6 и 8 ч).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Полученные в ходе проведения исследования данные свидетельствуют о выраженной динамическом влиянии обоих исследуемых соединений. Так, численность популяции Enterococcus sp. при интоксикации медью значительно снижалась на протяжении всего эксперимента и составила 29,67±1,76
КОЕ/мл при разведении 1×105
, что на 58,60% меньше фоновых значений (p<0,001), при этом наиболее значимое снижение регистрируется в первые часы с момента интоксикации и составляет 26,99%
(p<0,05) через 2 ч и 52,53% (p<0,01) через 4 ч соответственно. Присутствие кобальта оказывает более
выраженное ингибирующее действие на Enterococcus sp. со снижением численности через 2 ч на
33,49% (p<0,05), через 4 ч на 74,43% (p<0,01) и суммарным снижением к 8-му часу исследования на
81,40% (p<0,001) соответственно.
По отношению к E. coli регистрируется обратная зависимость. На фоне введения в организм
сульфата меди численность популяции достоверно увеличивается начиная с 4-го часа исследования
на 72,91% (p<0,05), через 6 ч на 78,85% (p<0,001) и через 8 ч на 96,02% (p<0,001) соответственно.
Присутствие кобальта в пищеварительном тракте также оказывает «стимулирующее» действие на
изменение численности популяции с максимальными показателями изменения численности, начиная
с 6-го часа, и составляет 79,19% (p<0,05), а на 8-й час 81,28%(p<0,01) по отношению к фоновым показателям.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследуемые бактериальные изоляты, формирующие микробиом кишечника крыс обладают выраженной толерантностью в отношении химических соединений кобальта и меди. Однако уровень
сорбции данных элементов незначителен и составляет в среднем 10,7% для E. coli (Cu) и 8,3% для
Lactobacillus sp. (Co). Оценка степени влияния металлов на микробиом кишечника в условиях острой
интоксикации косвенно подтверждает результаты исследования in vitro. Установлено, что численность популяции E. coli имеет достоверно низкие значения на фоне интоксикации кобальтом на
25,27% (p<0,05). Увеличение численности популяции клеток данного микроорганизма можно связать со снижением конкурентоспособности за питательные вещества на фоне снижения численности популяции других микроорганизмов, о чем свидетельствуют результаты подсчета Enterococcus sp.
Работа выполнена при поддержке государственного задания FSGU-2023-0007.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
Zhao L., Li X., Wang Y., et al. Resistance role of Lactobacillus sp. and Lactococcus sp. to copper ions
in healthy children's intestinal microorganisms. J Hazard Mater. 2024 May 5; 469: 134059. DOI:
10.1016/j.jhazmat.2024.134059.
Arun K.B., Madhavan A., Sindhu R., et al. Probiotics and gut microbiome – Prospects and challenges in
remediating heavy metal toxicity. J Hazard Mater. 2021 Oct 15; 420: 126676. DOI:
10.1016/j.jhazmat.2021.126676.